RNAシーケンスのワークフロー

本テクニカルノートでは、 RNAシーケンス次世代シーケンスを用いてサンプル中のRNAの量や配列を調べる技術。 More （RNA-seq）のワークフローについて解説しています。

RNA-seqのワークフローには4つのステップが含まれます(図1)。

ステップ 1:全RNARNA (Ribonucleic acid) はすべての細胞に存在する一本鎖核酸で、窒素塩基とリン酸基に結合したリボース糖であるヌクレオチドで構成されています。 More抽出

RNA-seqの最初のステップは、細胞や組織から全 RNA を抽出することです。RNA抽出後、Novogeneは3つの方法を使用してサンプル品質チェック(QC)を実行します:

1% アガロースゲル電気泳動サイズに基づいて核酸 (DNA または RNA) 断片を分離するために使用される電気泳動の一種。 More
ナノドロップでRNAの量と質の確認、および
アジレント2100によるRNA Integrity Number (RIN)をチェック(図1a)。RINは、サンプルのRNAの完全性を評価するために頻繁に使用される品質指標です(Kvastad et al.、2021; Novogene、2011)。

ステップ2：ライブラリーの構築

抽出された全RNAの品質が確認されると、ライブラリが生成され、RNAサンプルがシーケンサーと互換性を持つようになります。ゲノム DNADNAは「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More サンプルのワークフローと同様に、シーケンスライブラリは通常、最初にRNAを断片化することによって生成されます。ただし、RNAシーケンスライブラリの準備では、断片化されたRNA分子は逆転写RNAテンプレートからDNAを合成するプロセス。 More によってcDNAに変換されます。次に、シーケンシングアダプター他の DNA または RNA 分子の末端に連結できる、化学合成された短い一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド。 More が cDNAcDNA (complementary DNA) は、RNA 分子を鋳型として逆転写によって合成される DNA 配列です。 More フラグメントの両端に付加され、フラグメントが精製および増幅されます(図1b)(Novogene、2011)。

シーケンスされるRNAサンプルは、 mRNAmRNA (Messenger RNA) は、細胞にタンパク質を作るように指示する一本鎖 RNA の一種です。 More 、lncRNA、miRNA、circRNA、低分子RNA分子などの目的のRNAタイプに対して精製または濃縮されていることが重要です。rRNAは細胞のRNAの90%以上を構成するため、精製を行わないと、配列決定の読み取りの大部分はrRNAに対応します (Lodish et al.、2000)。さらに、シーケンスの読み取りは、精製なしでrRNAに偏ります。

ポリAテールを持つ真核生物のmRNAが目的のRNAである場合、通常、ポリA濃縮ライブラリーが行われ、250～300bpのインサートライブラリーが構築されることになります。ただし、mRNAに加えて、追加のRNA分子を分析する場合は、トランスクリプトームシーケンス全体を実行する必要があります。この場合、追加のライブラリー調製ステップが実行されます。これには、1) rRNAの除去と指向性RNAライブラリーの調製(lncRNA、miRNA、circRNAを取得するため)、および2) small RNAライブラリーの調製(小さなRNA分子を取得するため) (Novogene、2011)。

ステップ3：シーケンス

ライブラリはフローセルにロードされ、シーケンサーに配置されます。たとえば、イルミナのシーケンシング技術は、化学的なクラスター生成とシーケンシングを使用して、単一のフローセルで数百万または数十億のクラスターをシーケンシングします。シーケンス中、クラスターごとにベースコールが作成され、機器のソフトウェアによってシーケンスのサイクルごとに保存されます。ベースコールデータは、シーケンスが完了した後に分析できます(図1c) (Novogene、2011b)。

ステップ4：データ解析

シーケンスの後、装置のソフトウェアがヌクレオチド窒素塩基と糖およびリン酸基が結合した化合物。ヌクレオチドはDNAなどの核酸の基本構造単位を形成します。 More を識別し(ベースコールと呼ばれるプロセス)、これらのベースコールの信頼性と品質を判断します。データは、シーケンスデータを標準的な分析ツールにインポートすることで分析できます (図1d)。

図1. RNAシーケンスのワークフロー。

参考文献

Kvastad, L., Carlberg, K., Larsson, L. et al. (2021). The spatial RNA integrity number assay for in situ evaluation of transcriptome quality. Commun Biol, 4 (57). doi: org/10.1038/s42003-020-01573-1. https://www.nature.com/articles/s42003-020-01573-1

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L. et al. (2000). The Three Roles of RNA in Protein Synthesis. Molecular Cell Biology (4^thed.). W. H. Freeman. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/

Novogene. (2011). A basic guide to RNA-sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-basic-guide-to-rna-sequencing/