バックグラウンド
トランスクリプトームシーケンスとも呼ばれる RNAシーケンス次世代シーケンスを用いてサンプル中のRNAの量や配列を調べる技術。 More （RNARNA (Ribonucleic acid) はすべての細胞に存在する一本鎖核酸で、窒素塩基とリン酸基に結合したリボース糖であるヌクレオチドで構成されています。 More sequencing、RNA-seq) は、生物学的サンプルのトランスクリプトーム全体を詳細に研究、およびプロファイリングする手法です。RNA-seqは、遺伝子発現プロファイルを明らかにし、トランスクリプトームの連続的な変動を説明するために使用されます(Novogene、2011a)。また、リボソームRNA ( rRNArRNA (Ribosomal RNA) は、リボソームの主要構成要素である RNA の一種です。 More )、トランスファーRNA ( tRNAtRNA (Transfer RNA) は、タンパク質合成に関与する小さな RNA 分子です。 More )、メッセンジャーRNA ( mRNAmRNA (Messenger RNA) は、細胞にタンパク質を作るように指示する一本鎖 RNA の一種です。 More )、ノンコーディングRNA ( ncRNAncRNA (Non-coding RNA) は、タンパク質をコードしないゲノムから転写された RNA 分子です。 More ) などのさまざまなタイプのRNAを探索し、それらの発現レベル、アイソフォーム、修飾、突然 変異生物のゲノムの核酸配列の変化。 More を分析するためにも使用できます。時間の経過やさまざまな条件下で変化します (Corchete et al.、2020)。真核生物の全RNAにおけるさまざまな種類の RNA 分子に関する情報を表1に示します。研究対象のRNAの種類と回答する研究課題に応じて、さまざまな種類のRNA-seqを使用できます。
表1. さまざまな種類のRNA分子（Novogene、2011b）。
| RNAの種類 | 機能 | 全真核生物RNA中に占める割合 |
| Ribosomal RNA (rRNA) | 翻訳 | 80 – 90 |
| Transfer RNA (tRNA) | 翻訳 | 10-12 |
| Messenger RNA (mRNA) | タンパク質をコード | 3 – 7 |
| Non-coding RNA (ncRNA)Long non-coding RNA (IncRNA)Circulatory RNA (circRNA)MicroRNA (miRNA) | 転写調整 スプライシング調整 発現調整 他 | – |
| Small nuclear RNA (snRNA) | スプライシング調整 他 | – |
RNAシーケンス技術の開発
図1は、さまざまなRNA-seq技術の開発タイムラインを示しています。第一世代の配列決定技術である サンガー配列決定インビトロ DNA 複製中の DNA ポリメラーゼによる鎖終結ジデオキシヌクレオチド (ddNTP) の選択的取り込みに基づく DNA 配列決定技術。 More は1977年に開始され、その後1980年代にマイクロアレイ技術が導入されました。サンガーシーケンスには、スループットが低くコストが高いなどの欠点があり (Choudhuri、2014)、マイクロアレイの使用には遺伝子配列の事前知識が必要であり、新しい遺伝子発現を特定することができません(Hong et al.、2020)。そこで、 次世代シーケンス次世代シーケンス（NGS、Next generation sequencing) は、ゲノム全体、あるいはDNAやRNAの標的領域のヌクレオチドの順序を同時に決定できる強力な技術です。 More （またはハイスループットシーケンシング）が開発され、2005年に最初の次世代シーケンシングプラットフォーム（454 Life Sciences pyrosequencing）が登場しました。2005 年以降、ゲノムを解明するための詳細な研究が可能になりました。生物学的サンプルのトランスクリプトーム。 454 Life Sciences パイロシーケンシングのリリース後、他のいくつかの次世代シーケンシングプラットフォームが続きました(たとえば、Illumina NovaSeq 6000 と MiSeq、Applied Biosystems Instruments (ABI) オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出 (SOLiD) によるシーケンシング、Pacific Biosciences (PacBio) シングル分子リアルタイム(SMRT)シーケンス、Complete Genomics DNA ナノボールシーケンス(DNBS)、Helico Biosciences 単分子蛍光シーケンス、Thermo Fisher Scientific (TFS) Ion Torrent、Oxford Nanopore Technologies ナノポアシーケンスなど)。
時間の経過とともに、RNA-seqは、トランスクリプトーム解析のための従来のマイクロアレイに代わる方法として登場しました。マイクロアレイと比較して、RNA-seqは新しい転写産物の研究を可能にし、より高い解像度とより優れた検出を提供し、技術的なばらつきを抑えます。RNA-seqからの結果(例えば、絶対的および相対的な遺伝子発現測定レベル)は、トランスクリプトミクスのゴールドスタンダードであるリアルタイム定量的逆転写RNAテンプレートからDNAを合成するプロセス。 Moreポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) によって得られた結果とも非常に互換性があります(Corchete et al.、2020）。
図1. さまざまなRNA-seq技術の開発タイムライン(Hong et al.、2020 から改変)
1ヒトゲノムプロジェクトは、ヒトゲノム全体と、さらによく研究されているいくつかの生物のゲノム全体の配列決定と同定を目的とした大規模な国際プロジェクトです(NIH、2023)。2454 ライフサイエンス Roche 454パイロシーケンシング技術は、「合成による配列決定」法を使用します。3Illumina NovaSeq 6000 およびMiSeqは、「リバーシブル ターミネーター シーケンス」法を使用します。4オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出 (SOLiD) 技術は、Applied Biosystems Instruments (ABI) によって開発されました。5Roche 454 パイロシーケンシング技術と同様に、Pacific Biosciences (PacBio) の単一分子リアルタイム (SMRT) 技術も「合成による配列決定」法を使用します。6完全ゲノミクスDNAナノボールシーケンス(DNBS)は、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション法を使用します。7Helico Biosciences Helicos の単分子蛍光配列決定では、ハイブリダイゼーションおよび合成法を使用します。8Thermo Fisher Scientific (TFS) の Ion Torrent は、「合成による配列決定」法に基づいています。9Oxford Nanopore Technologies (ONT) は、配列決定方法としてナノポア配列決定を使用しています。10454ライフサイエンスパイロシーケンシング、イルミナ NovaSeq 6000 およびMiSeq、ABI SOLiD、Complete Genomics DNBS、454 ライフ サイエンス Ion Torrent テクノロジーはすべて、次世代シーケンシングプラットフォームです。11PacBio SMRT、Helicos シーケンス、および ONT ナノポアシーケンスは、第3世代のシーケンスプラットフォームです。
参考文献
Choudhuri, S. (2014). Bioinformatics for beginners: Genes, genomes, molecular evolution, databases and analytical tools. Elsevier Inc. https://www.sciencedirect.com/book/9780124104716/bioinformatics-for-beginners
Corchete, L.A., Rojas, E.A., Alonso-López, D. et al. (2020). Systematic comparison and assessment of RNA-seq procedures for gene expression quantitative analysis. Sci Rep, 10: 19737. doi: org/10.1038/s41598-020-76881-x. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33184454/
Hong, M., Tao, S., Zhang, L., et al. (2020). RNA sequencing: new technologies and applications in cancer research. J Hematol Oncol, 13(1): 166. doi: 10.1186/s13045-020-01005-x. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33276803/
NIH. (2023). Human Genome Project. National Human Genome Research Institute. https://www.genome.gov/about-genomics/educational-resources/fact-sheets/human-genome-project
Novogene. (2011a). Introduction to RNA sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/transcriptome-sequencing/mrna-sequencing/
Novogene. (2011b). A basic guide to RNA-sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-basic-guide-to-rna-sequencing/
Zhou, Y. (2022). A beginner’s guide to DNA-seq: bioinformatics analysis [webinar]. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/onlineevent/a-beginners-guide-to-dna-seq-bioinformatics-analysis/