DNAシーケンスのアプリケーションとワークフロー

このテクニカルノートでは、 DNAシーケンス のアプリケーションとDNAシーケンスのワークフローに関する情報を提供しています。

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DNAシーケンスの応用

DNAシーケンス技術は、さまざまな研究課題に答えるために使用することができ、使用するアプローチは、研究に関わるパラメータと必要な情報の種類によって異なります（Novogene、2011a）。図1は、各DNAシーケンサーのアプリケーションの概要を示しています。

図1. さまざまなDNAシーケンスのアプリケーションの概要（Novogene、2011aから改変）。

ホールゲノムシーケンス (Whole genome sequencing、WGS)

WGS は、サンプル中のタンパク質コード領域と非コードDNA領域を含む全ゲノムを、30倍を超える深さのシーケンスで包括的に解析するものです。ヒト、動物、植物、微生物のゲノムをシーケンスし、ゲノムの様々な変異を同定するために使用することができます（Novogene、2011a）。

De novoシーケンスとresequencingは、WGSの2つの主要なアプローチです。 De novoシーケンス は、アライメントに利用できる参照配列がない新規ゲノムをマッピングするために使用されます。一方、再シーケンスは、 一塩基変異 （Single nucleotide variants、SNV）、 挿入 、 欠失 、 転座 などの遺伝子変異を特定するために、アライメントのための参照配列を使用してゲノムを調査します（Illumina、2023a；Novogene、2011a）。

ホールエクソームシーケンス (Whole exome sequencing、WES)

WES は、ゲノムのタンパク質コード領域（またはエクソーム）のみを、50～100倍以上の深さのシーケンスで調べます。WGSと比較すると、生成されるデータ量が大幅に少ないため、シーケンスや解析のコストが低くなります。また、WESはWGSよりも精度が高い。エクソームはゲノムの2%未満に過ぎませんが、既知の疾患関連遺伝子変異の85%が含まれており、疾患の遺伝的原因の特定に有用です（Delanne et al、2021; Illumina、2023a）。

ターゲット領域シーケンス（Target region sequencing、TRS) 

TRS は、特定の機能を持つゲノムの特定の領域、例えば、疾患や特定の表現型に関連する可能性が高い領域に焦点を当てます。変異の解析や希少なバリアントの同定に有用です。TRSは、WGSやWESと比較して、はるかに高い深度（500倍以上）でのシーケンスが可能であり、費用対効果が高いのが特長です（Novogene、2011b）。

TRSにはハイブリダイゼーションキャプチャーとアンプリコンシーケンスの2種類があり、その違いは表1に示す通りです。

表1. ハイブリダイゼーションキャプチャーとアンプリコンシーケンスの比較（Novogene、2011a）。

WGS、WES、TRSの仕様は図2に示す通りです。

図2. WGS、WES、TRSの比較。SNP = Single nucleotide variant、一塩基変異、InDel = Insertions and deletion、挿入と欠失、SV　= Structural variant、構造変異、CNV = Copy number variant、コピー数変異 (Novogene、2011a).

メタゲノムシーケンス

メタゲノムシーケンス は、微生物群集の全ゲノムを網羅的に解析することができます。これにより、微生物の多様性を評価し、これらのコミュニティ内の微生物を検出することができます。アンプリコンシーケンスとショットガンシーケンスは、メタゲノムシーケンスの2つのタイプです（Illumina、2023c; Novogene、2011a）。

エピジェネティック・シーケンス

エピジェネティック・シーケンス とは、遺伝子型を変えずに、環境の結果として遺伝子の表現型に起こる変化を研究するものです。エピジェネティックシーケンスには、DNAメチル化を対象とする全ゲノムビスルファイトシーケンス、ヒストン修飾や 転写因子 を調べるクロマチン免疫沈降シーケンス（ChiP-seq）、RNA-タンパク質相互作用を解析するRNA免疫沈降シーケンス（RIP-seq）などの技術があります (Novogene、2011a).

DNAシーケンスのワークフロー

DNAシーケンスのワークフローは、4つのステップで構成されています（図3）。

ステップ1：サンプルの準備

DNAシーケンスは、細胞培養、新鮮凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded、FFPE）組織、血液、唾液、骨髄など、DNAまたは cDNA を生成するあらゆるサンプルに対して実行できます（図3a）。

ステップ2：ライブラリーの作成

DNAサンプルがシーケンサーと互換性を持つようにするために、 ライブラリー を作成します。シーケンスライブラリーは通常、DNAを断片化し、断片の両端に専用の アダプター をライゲーションすることで作成します（図3b）。その後、断片を増幅し、精製します（Illumina、2023b）。

ステップ3：シーケンス

ライブラリーはフローセルにロードされ、シーケンサーに乗せられます。DNA断片のライブラリーは、クラスター生成として知られるプロセスで増幅され、数百万コピーの一本鎖DNAが得られます（Illumina、2023b）。第2世代シーケンサーまたはSBSのプロセスが行われ、詳細はこのテクニカルノートの以前のセクションで説明されています（図3c）。

ステップ4：データ解析 

シーケンス後、装置ソフトウェアが ヌクレオチド を特定し（ベースコールと呼ばれるプロセス）、そのベースコールの予測精度を確認します（図3d）。データは、標準的な解析ツールにシーケンスデータをインポートすることで解析することができます。

図3. 典型的なDNAシーケンスのワークフロー。

参考文献

Delanne, J., Bruel, A.L., Huet, F., et al. (2021). The diagnostic rate of inherited metabolic disorders by exome sequencing in a cohort of 547 individuals with developmental disorders. Mol. Genet, 29: 100812. doi: 10.1016/j.ymgmr.2021.100812.  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34712575/

Illumina. (2023a). What is whole-genome sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/whole-genome-sequencing.html

Illumina. (2023b). Main steps in next-generation sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/beginners/ngs-workflow.html

Illumina. (2023c). What is shotgun metagenomic sequencing. Illumina, Inc. https://www.illumina.com/areas-of-interest/microbiology/microbial-sequencing-methods/shotgun-metagenomic-sequencing.html

Novogene. (2011a). A beginner’s guide to DNA sequencing. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/a-beginners-guide-to-dna-sequencing-blog/

Novogene. (2011b). What is target region sequencing?. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/services/research-services/genome-sequencing/target-capture-sequencing/target-region-sequencing-trs/