このテクニカルノートは、 次世代シーケンス次世代シーケンス（NGS、Next generation sequencing) は、ゲノム全体、あるいはDNAやRNAの標的領域のヌクレオチドの順序を同時に決定できる強力な技術です。 More （NGS）のワークフローについて解説しています。
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典型的なIllumina NGSのワークフローは、4つのステップを含みます： 1） ライブラリーNGSを行う場合に創るやつ。 More 調製、2）ブリッジ増幅とクラスター生成、3）シーケンス、4）アライメントとデータ解析です。イルミナNGSのワークフローの模式図を図1に示します。
ステップ1：DNAシーケンスライブラリーの調製
抽出した DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More または cDNAcDNA (complementary DNA) は、RNA 分子を鋳型として逆転写によって合成される DNA 配列です。 More （出発物質が RNARNA (Ribonucleic acid) はすべての細胞に存在する一本鎖核酸で、窒素塩基とリン酸基に結合したリボース糖であるヌクレオチドで構成されています。 More の場合）のDNAサンプルは、まず200-500 bpのDNA断片に細断されます（Novogene、2011）。この断片の両端に、還元サイクル増幅法により アダプター他の DNA または RNA 分子の末端に連結できる、化学合成された短い一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド。 More がライゲーションされます（図1a）。各アダプターは、シーケンシングプライマー結合部位、インデックス配列、ライブラリーフラグメントをフローセルに付着させる部位を備えています。アダプターは5’末端と3’末端に特異的であり、同じインデックスを共有しながら、シーケンス結合部位とフラグメント結合部位が異なっています。二本鎖DNA断片は、一本鎖を形成するために変性され、フローセルに加えられます（Choudhuri、2014）。
ステップ2：ブリッジ増幅とクラスター生成
フローセルは、アダプターに相補的な2種類の表面固定型 オリゴヌクレオチドヌクレオチド数が少なく、短くて直鎖状のDNAまたはRNA More （オリゴ）を塗布したガラス製セルです（図1b）。1種類の表面固定型オリゴに固定化された鎖がハイブリダイゼーション鎖です（図1b）。
固定化された断片は、標準的な PCRPCR（Polymerase chain reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）は、変性、オリゴヌクレオチドのアニーリング、および DNA ポリメラーゼ伸長のサイクルを繰り返すことによる核酸配列の酵素的増幅を伴う技術です。 More 増幅を行うことで、元の断片のコピーが多数生成され、密なクラスターに局在するようになる（図1c）。その後、二本鎖のPCR産物が変性し、元の鎖（表面に固定されたプライマーにハイブリダイズして増幅のための鋳型となる）が洗い流され、新たに合成された鎖が表面に固定されます（図1d）。この表面に固定された一本鎖が折り返され、アダプター領域がフローセル上の2種類目のオリゴとハイブリダイズしてブリッジを形成します（図1e）。相補的な鎖が合成され、二本鎖のブリッジが形成されます（図1f）。このようなPCR増幅の過程をブリッジ増幅と呼びます。その後、二本鎖のブリッジは変性し、2本の一本鎖のコピーとなり、それぞれのブリッジは表面に固定されます（図1g）。ブリッジ増幅PCRサイクルを繰り返すと、一本鎖の増幅産物が密集したクラスターが得られます（図1h）。このようにして、数百万個のユニークなクラスターが生成されます。逆鎖は切断され、洗い流され、順鎖のクラスターが残ります（図1h）。3’末端は、不要なプライミングを防ぐためにブロックされます（Choudhuri、2014）。
ステップ3：シーケンシング
シーケンシング プライマーDNA合成を開始するための短い一本鎖核酸。 More を用いて、鎖の塩基配列を決定する。最初のシーケンスサイクルは、蛍光標識された4つの可逆的ターミネーター塩基（各塩基は異なる蛍光標識を含んでいます）、シーケンスプライマー、および DNAポリメラーゼDNAの構成要素であるヌクレオチドを組み立ててDNA分子を作り出す酵素。 More をフローセルに加えることで開始されます。ポリメラーゼは一塩基伸長しかできないため、鋳型鎖に相補的な塩基のみが組み込まれ、追加された塩基の3’末端がブロックされるため伸長は停止します。その後、取り込まれなかった塩基は除去され、付加された塩基はレーザーで励起され、蛍光をCCDカメラで撮影します。こうして、最初の塩基が画像化されます。各フラグメントの第1塩基も同様に記録され、画像化されます。同様に、付加された第2塩基はすべてのフラグメントについて画像化されます（Choudhuri、2014）。
このサイクルを繰り返し、各フラグメントの塩基配列を1塩基ずつ決定します（図1i）（Choudhuri、2014）。このプロセスは数百万個の断片に対して行われるため、超並列配列決定と呼ばれます。順鎖のシーケンシングが完了すると、3′末端がブロックされなくなり、逆鎖を生成するためにブリッジ増幅の別のサイクルが実行されます。順鎖は切断され除去され、逆鎖も同様に配列決定される。順鎖の配列決定のみが行われる場合、 シングルエンドシーケンスシングルエンドシーケンスとは、シーケンスプロセスが単一方向からのみ実行されることです。 More と呼ばれます。逆鎖もシーケンスする場合は、 ペアエンドシーケンスペアエンドシーケンスでは、DNA は両方向からシーケンスされます。 More と呼ばれます。シーケンス結果は、FastaQファイル（Novogene、2011）に保存されます。
ステップ4：アライメントとデータ解析
品質管理チェックが行われ、配列は固有のインデックスを使用して正しいライブラリに割り当てられます。その後、類似の塩基配列を持つ リード次世代シーケンスでは、リードはシーケンスされる DNA フラグメントです。 More をクラスタリングし、フォワードリードとリバースリード（ある場合）をペアリングして、連続した配列（コンティグ）を生成します。これらのコンティグは、参照ゲノムとアライメントされます。参照ゲノムがなく、配列が新しい場合は、de novoアセンブリデノボアセンブリは、それらの断片の正しい配列や順序に関する先験的な知識を持たずに、多数の (短いまたは長い) DNA 断片からゲノムを構築する方法です。 More 法（Choudhuri、2014; Novogene、2011）によって配列アライメントが行われます。
図1. IlluminaのNGSワークフロー（Choudhuri、2014から改変）。
参考文献
Bunnik, E. M., Le Roch, K. G. (2013). An introduction to functional genomics and systems biology. Adv Wound Care (New Rochelle), 2(9): 490-498. doi: 10.1089/wound.2012.0379. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816999/
Choudhuri, S. (2014). Bioinformatics for beginners: Genes, genomes, molecular evolution, databases and analytical tools. Elsevier Inc. https://www.sciencedirect.com/book/9780124104716/bioinformatics-for-beginners
Novogene. (2011). Next generation sequencing (NGS): a beginner’s guide. Novogene Co., Ltd. https://www.novogene.com/us-en/resources/blog/ngs-beginners-guide/