Twist Bioscienceの遺伝子断片
遺伝子断片エクソン（タンパク質合成をコードするゲノムの領域）のみを含む直線状の二本鎖DNA配列。 More は、直線状の二本鎖 DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More 配列です。 Twist Bioscienceの遺伝子断片は、シリコンベースのDNA合成技術を使用して一本鎖オリゴから合成されます (図 1)。この技術により、長さ300 ～ 1800 bpの二本鎖DNAフラグメントを低エラー率で生成できます (図 2および3)。
図 1. Twist Bioscienceの遺伝子断片合成ワークフロー。シリコンチップは、b) の挿入突然変異の一種で、DNAセグメントに1つ以上のヌクレオチドが付加されます。 More図に示されています。ワークフローは4つの主なステップに分けることができます: (a) 目的の遺伝子の選択とその配列の設計、b) シリコンベースのプラットフォームでの一本鎖オリゴの化学合成、c) オリゴのアニーリングによる遺伝子フラグメントのアセンブリと生産PCR増幅による二本鎖DNA断片の製造、およびd) お客様への直鎖状二本鎖DNA断片の出荷。エラー率を測定する必要がある場合は、ステップ d) の代わりに、ステップ e) ～ g) が行われます。 e) DNA断片をプラスミドにクローニングする。 f) 細胞へのプラスミドの形質転換、コロニーを成長させるための寒天プレートへのプレーティング、およびスクリーニングによる目的のコロニーの選択。 g) 配列決定および分析による、選択されたコロニーの配列の検証。
低エラー率で合成された遺伝子断片
「オリゴプール」のセクションで述べたように、オリゴ合成中にエラーが発生する可能性が高く (図 1b)、突然変異生物のゲノムの核酸配列の変化。 Moreが発生する可能性があります。合成オリゴに残っているエラーは、アセンブリプロセス中に持ち越され (図 1c)、下流のコンストラクトに蓄積されます (Ma et al.、 2012)。 したがって、合成された遺伝子フラグメントのエラー率を測定することで、最終的な合成 DNA 配列の精度を予測することができます。
Twist Bioscienceの遺伝子断片のエラー率を評価するために、300 bpから1,800 bpまでの長さで、各遺伝子間で100塩基ずつ増加する同一の二本鎖DNA断片をTwist BioscienceおよびIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)から購入しました。各社から提供されたDNAフラグメントをpTwist Amp High Copy プラスミド細菌やその他の微小生物に見られる小さな環状DNA。 More にクローニングし(図 1e)、DH10B様細胞に形質転換し、100 μg/mLカルベニシリンを含むLB寒天プレートに播種しました (図 1f)。形質導入された細胞を37oCで一晩インキュベートした後、各遺伝子について20個のコロニーを選択し (図 1f)、NGSを使用して配列を検証しました (図 1g) (Twist Bioscience、 2023)。
図 ２は、Twist Bioscienceの遺伝子断片とIDTのgBlockおよびeBlockとの間の平均エラー率を示しています。エラー率は、検出されたシーケンスエラーの総数をシーケンスされた塩基対の総数で割って計算されました (Twist Bioscience、2023)。 Twist Bioscienceの遺伝子断片と同様に、IDTのgBlocks とeBlocksもクローン化されていない二本鎖の直鎖状DNA断片です。図 2で観察されるように、Twist Bioscienceの遺伝子フラグメントは、 IDTのgBlocksと比較して、サイズ範囲全体でエラー率が1: 5,367 bpで、エラー率がほぼ2倍減少、もしくは配列忠実度が2倍高い精度を示しました。 さらに、300 ～ 800 bpの範囲で、IDTのeBlockよりもTwist Bioscienceの遺伝子フラグメントが1.7倍改善され、エラー率は1: 6,235 bpでした。 したがって、Twist BioscienceはIDTよりもはるかに低いエラー率で優れたパフォーマンスを発揮しました。エラー率が低いと配列精度が向上し、正しいクローンまたは完全なクローンを取得するためのピッキングとスクリーニングの労力が削減され、最終的に時間とコストの節約につながります。
図 2. Twist Bioscienceの遺伝子断片とIDTのgBlockおよびeBlockの平均エラー率の比較。エラー率は、検出されたシーケンス エラーの総数をシーケンスされた塩基対の総数で割ることによって計算されました (Twist Bioscience、2023)。
スクリーニング作業に対するエラー率の影響を評価するために、Twist Bioscienceの遺伝子断片とIDT のgBlocksおよびeBlocksのさまざまな遺伝子長と配列にわたる配列完全クローンのパーセンテージを比較しました (図 3)。データは、さまざまな合成生物学のアプリケーションに必要な遺伝子の長さの多様性を反映するために、さまざまな遺伝子の長さを持つ63のシーケンスのセットを使用して生成されました。 図 3 では、Twist Bioscienceの遺伝子フラグメントが、検証したほぼすべての遺伝子長で完全クローンの割合が最も高かったことが観察されています。完璧なクローンの割合は、DNA断片のサイズに応じて指数関数的に減少しました。これは、フラグメントが長くなるにつれて配列精度の影響が大きくなることを示しています (図 3)。全体として、Twist Bioscienceの遺伝子断片の配列精度が高いため、IDTのものと比較して、正確または完全なクローンを取得する労力が少なくてすみます。
図 3. Twist BioscienceとIDTによって作成されたさまざまな長さのDNA断片の完全なクローンの割合の比較 (Twist Bioscience、2023)。
参考文献
Ma, S., Saaem, I., Tian, J. 2012. Error Correction in Gene Synthesis Technology. Trends Biotechnology, 30(3), 147-154. doi: 10.1016/j.tibtech.2011.10.002. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22209624/
Twist Bioscience. January 2023b. Twist Gene Fragments. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/resources/product-sheet/gene-fragments