オリゴプール一本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴ）のコレクションまたはライブラリー。 More は、一本鎖 オリゴヌクレオチドヌクレオチド数が少なく、短くて直鎖状のDNAまたはRNA More (オリゴ) のコレクションまたはライブラリです。 Twist Bioscience によって製造されたオリゴプールは、同社のシリコン・ベースの DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More 合成技術を使用して合成されます (図 1)。この技術では、96ウェル プレートと同じフットプリントを持つシリコン チップを使用して、一度に100万個のオリゴ シーケンスを生成します。各シリコン チップには数千個の個別のクラスターが含まれており、それぞれに固有のオリゴ シーケンスを合成できる121の個別にアドレス指定可能な表面が含まれています (図 1b に挿入突然変異の一種で、DNAセグメントに1つ以上のヌクレオチドが付加されます。 More)。この技術により、Twist Bioscienceは、最大300塩基、高い精度と均一性 (図 2および 4)、およびエラー率の低い (図 3) プールされたオリゴ配列をお客様に提供します。
Twist Bioscienceのオリゴプール
図 1. Twist Bioscience のオリゴ プール合成ワークフロー。シリコン チップは、b) の挿入図に示されています。例えばCRISPRスクリーニングのためにsgRNAのライブラリを合成する場合のワークフローは6つの主なステップに分けることができます: (a) 目的の遺伝子の選択とこれらの遺伝子に対するsgRNAライブラリの設計、b) シリコンベースのプラットフォームでのオリゴプールをコードするsgRNAの化学合成、c) によるオリゴプールの増幅PCR、d) プール内の個々のオリゴを発現ベクターにクローニングして、e) プラスミドライブラリープールを生成し、f) 配列決定と分析によるsgRNAの確認。
高い均一性と低いエラー率で合成されたオリゴプール
オリゴプールが最適な状態で機能するためには、可能な限り最高の忠実度を持つ全長オリゴ (つまり、正しい配列と長さのオリゴ) で均一に構成されている必要があります。 CRISPRスクリーニングなどのアプリケーションのワークフロー中に、次世代シーケンシング (Next generation sequencing、NGS) ステップで増幅されたシグナル対ノイズ比の結果を達成し、ワークフロー中にスクリーニングごとにより多くの真のターゲットヒットを達成するには、エラーの少ない高度に均一なオリゴプールを使用することが重要です。
S/N比は、目的のシグナルのレベルをバックグラウンドノイズのレベルと比較するために使用される尺度です。エラーのある不均一なオリゴ プールを使用すると、NGSデータのバックグラウンドノイズが高くなり、真のターゲットのシグナルが目立ちにくくなります。また、偽陽性が検出される可能性もあります。この場合、真陽性と偽陽性を区別するために、より多くのNGS検証が必要です。使用するオリゴプールが高精度 (つまり、高い均一性と低いエラー) で作成されている場合、S/N比を改善できます。その結果、必要なデータを取得するための労力が減り、下流のNGS検証の時間とコストが節約されます。したがって、均一性とエラー率を測定することで、合成されたオリゴプールの精度と効率を予測できます。
Twist Bioscience のオリゴプールは非常に均一であることが示され (図 2)、配列の90%が平均値の2.0倍未満のシグナルでタイトなベル型分布で存在し、100%の表現を保証します。
図 2. Twist Bioscienceの合成オリゴプールの均一性の分析 (Twist Bioscience、2023)。
オリゴ合成の過程における化学は完全ではないため、分子のごく一部でランダムな配列エラーが発生する可能性があり、正確なオリゴ配列の合成を妨げる可能性があります。オリゴ合成で最も頻繁に起こるタイプのエラーは、新しいヌクレオチドが伸長鎖に結合できないときに発生します。結合していない鎖は通常、オリゴ合成中の アセチル化化合物中の水素原子がアセチル基（CH3C=O基）に置換される化学反応。 More によって成長を停止しますが、オリゴ配列の欠失DNA セグメントから 1 つ以上のヌクレオチドが失われる突然変異の一種。 More、挿入、または置換エラーにつながるアセチル化の失敗が発生します (Ma et al.、 2012)。これらのエラーは、正確な遺伝子編集や最大限の効率での CRISPRCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats ）は規則的に繰り返し現れるDNA断片です。 More スクリーニングなどのダウンストリーム アプリケーション用の正確な sgRNAsgRNA（シングルガイドRNA）は、CRISPR技術において、目的の標的DNA領域を認識し、そこにCasヌクレアーゼを誘導して編集を行う特異的なRNA配列です。sgRNAは、標的DNAに相補的な17-20塩基配列であるcrispr RNA（crRNA）と、Casヌクレアーゼの結合足場となるtracr RNAの2つの部分から構成されています。 More ライブラリーの生成を妨げます。 Twist Bioscienceによって合成されたプールされたオリゴ配列の精度を測定するために、エラー率が測定されました。業界をリードするエラー率 1: 2000 nt (図 3) の測定値により、高い精度とターゲット特異性が保証されます。
図 3. Twist Bioscienceの合成オリゴプールのエラー率の分析 (Twist Bioscience、2023)。
Twist Bioscienceによって合成されたオリゴプールの均一性 (図 4a) を、アレイベースの競合他社によって作成されたオリゴプールの均一性 (図 4b) と比較することによってさらに調査しました。両社のオリゴプールを増幅し、 ベクター生物内で安定的に維持できる小さなDNA断片で、クローニングの目的で外来DNA断片を挿入することができます。 More にクローニングした後、NGSで配列決定し、オリゴ配列の均一性を比較しました。各プールから生成されたクローンのNGSベースの検証では、Twist Bioscienceのオリゴプールの配列は、競合他社のプール (図 4b) と比較して、より均一な配列表現を持っていることが示されています (図 4a)。
図 4. (a) Twist Bioscienceと(b) アレイベースの競合他社によって合成されたオリゴプール間の均一性の比較 (Twist Bioscience、2023)。
Twist Bioscienceとアレイベースの競合他社によって生成されたオリゴプールのシーケンス解析結果を比較すると (表 1)、Twist Bioscienceのオリゴプールには予想される配列の100%が含まれており、競合他社のオリゴプールよりも高いパーセンテージの正しい配列が含まれています (表 1)。したがって、Twist Bioscienceによって合成されたより均一なオリゴプールは、競合他社のものと比較して、最大の効率で精密遺伝子編集およびCRISPRスクリーニングのためのより正確で高品質のsgRNAライブラリーを生成することが期待されます。
表 1. Twist Bioscienceとアレイベースの競合他社によって合成されたオリゴプールのシーケンス解析 (Twist Bioscience、2023)。
| Analysis | Twist oligo pool | Array-based competitor oligo pool |
| sgRNA recovered | 100% | >99.5% |
| % correct sequence (MiSeq) | ∼87% | >∼74% |
| % correct sequence (Sanger, 10 clones) | ∼100% | >∼70% |
参考文献
Ma, S., Saaem, I., Tian, J. (2012). Error Correction in Gene Synthesis Technology. Trends Biotechnology, 30(3), 147-154. doi: 10.1016/j.tibtech.2011.10.002. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22209624/
Twist Bioscience. (2023). Oligo Pools. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/resources/product-sheet/twist-oligo-pools