コンビナトリアル異変体ライブラリーコンビナトリアル異変体ライブラリー（Combinatorial variant library、CVL）は、タンパク質の特定のドメインにわたって同時に複数の位置で変異させたバリアントのコレクションです。 More （Combinatorial variant library、CVL）は、タンパク質の特定のドメインにわたって同時に複数の位置で変異生物のゲノムの核酸配列の変化。 Moreさせたバリアントのコレクションです。CVLの多様性は 野生型自然集団で最も頻繁に見られる遺伝子と特性と表現型。 More 配列に沿った1つ以上のドメインに限定されます。CVL内の変異体突然変異によって生じる生物または新しい遺伝的性質。 Moreは、各ドメインのすべての位置で組み合わされた正確なコドン置換によって異なります。CVLは、各バリアント位置におけるアミノ酸分布のユニークな比率を定義したり、ドメインごとの野生型配列からの変化の総数を定義したりすることを可能にします。CVLの多様性の合計は1010バリアントにもなります（Willems、2023)。
CVLsは主に抗体の探索や、より優れた特性（安定性、結合親和性、酵素活性など）を持つタンパク質を発現する変異体の作製に用いられます（Twist Bioscience、2023a、b）。Twistによって生産されたCVLは単一のプールとして納品され、各バリアントは複数の変異を含みます（表1）。表1にTwist社のCVLの仕様を示します。
表1. TwistのCVLの仕様（Twist Bioscience、2023a）。
| 製品形式 | 直鎖二本鎖DNA |
| 注文制限 | 本数制限なし |
| 収率 | すべてのポジションを1本のチューブに合計1 µgまで（長さによります） |
| 納期 | ４～６週間（プロジェクトによります） |
異変体ライブラリーを作製する従来の方法には、 ランダム変異誘発法DNA配列全体にランダムに変異を導入する技術。 More （エラーが起こりやすいPCR（error-prone PCR、epPCR）など）、組換え変異誘発法、 コンビナトリアル変異誘発法DNA配列内の複数の位置を同時に変異させる部位特異的手法であり、各変異体には複数の変異が含まれています。 More （NNK、TRIMなど）、 部位特異的変異誘発法二本鎖DNAやプラスミドのある領域、あるいは異なる領域内の特定の位置、あるいは連続したアミノ酸に変異を与える方法。 More などがあるが、一般に、コドン使用量の制御が制限され、配列バイアスが存在し、所望のバリアントの生成が不完全であるなどの欠点や限界があります。その代わりに、Twistはシリコンベースの合成プラットフォームを使って高品質のオリゴプールを生成し、正確で完全にカスタマイズされたユーザー定義のCVLを構築します（Willems, 2023）。表2は、Twist社のCVLの特徴を他の生成方法と比較して示しています。
表2. 様々なCVL生成法の比較（Twist Bioscience、2023a、b）。
| NNK・NNS | TRIM/Trimer | TwistのCVLs | |
| シーケンスバイアスを排除 | × | × | ○ |
| 利用可能なコドンの数 | 32 | 20 | すべて64 |
| 不要なモチーフを除去 | × | × | ○ |
| コドンの最適化が可能 | × | × | ○ |
| ストップコドンの回避 | × | ○ | ○ |
CVL合成ワークフロー
TwistのCVLは、96ウェルプレートと同じフットプリントを持つシリコンベースのプラットフォームで合成され、一度に100万個の オリゴヌクレオチドヌクレオチド数が少なく、短くて直鎖状のDNAまたはRNA More （オリゴ）配列を生成します（図1bの挿入突然変異の一種で、DNAセグメントに1つ以上のヌクレオチドが付加されます。 More部分）。このワークフローでは、シリコンベースの合成プラットフォームが オリゴプール一本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴ）のコレクションまたはライブラリー。 More を生成し、一本鎖オリゴのコレクション（図1bの挿入部分と図1c）をCVLの構築に使用します（図1d）。その後、ライブラリーのバリアントがアセンブルされ、発現 ベクター生物内で安定的に維持できる小さなDNA断片で、クローニングの目的で外来DNA断片を挿入することができます。 More にクローニングされ、微生物で増殖され、スクリーニングされ（図1e）、NGSでシーケンスされた後（図1f）、顧客に出荷されます（図1g）（Twist Bioscience、2023a）。
図1. TwistによるCVL合成のワークフロー。
CVLの品質
図2はTwistのCVLのNGS QCレポートです。1つのドメインにわたる8つの連続したアミノ酸位置にバリアントが存在します。最初の7つの位置には20アミノ酸残基がすべて各位置で5％のアミノ酸の比率となるように、また、8番目の位置には4つのアミノ酸が25％になるように設計されました。NGSレポートの結果から、これらのアミノ酸比率が、設計通りに存在することが確認されました。全バリアントの多様性は5 x 109でした。この結果は、TwistのCVLが、特定の変異位置におけるアミノ酸分布のユニークな比率を定義して作ることができることを示しています。また、TwistのCVLはすべての位置でアミノ酸比の均一性が高いことも示されました。すべての位置で期待されるすべての変異体が存在し、ほとんどすべてが望ましい比率でした(Twist Bioscience、2023a)。
図2. Twistが作成したCVLのQCレポート（Twist Bioscience、2023a）。
参考文献
Twist Bioscience. (2023a). Combinatorial variant libraries. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/sites/default/files/datasheets-2019-04/ProductSheet_Libraries_CVL_18Sep18_Rev1.pdf
Twist Bioscience. (2023b). Variant libraries. Twist Bioscience. https://twistbioscience.yokohama/pdf/Brochure_Libraries_2OCT20_Rev1.0_1.pdf
Willems, B. (2023). Twist DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More variant libraries [PowerPoint slides]. Twist Bioscience.