部位飽和バリアントライブラリー部位飽和バリアントライブラリー（Site saturation variant library、SSVL）は、20個のコドンすべて、または指定された数の所望のコドンに対して、一度に1つの位置で変異させたバリアントのコレクションです。 More （Site saturation variant library、SSVL)は、20個の コドンDNAまたはRNA分子の遺伝暗号の単位を形成する3つのヌクレオチドの配列。 More すべて、または指定された数の所望のコドンに対して、一度に1つの位置で変異生物のゲノムの核酸配列の変化。 Moreさせたバリアントのコレクションです。 したがって、変異は正確な単一コドン置換によって行われます（Willems、2023)。SSVLは、配列、タンパク質の構造、機能の間の関係を理解するために、与えられたタンパク質の各アミノ酸の系統的な機能スクリーニングを行うのに有用です（Twist Bioscience、2023a; Willems、2023）。Twistでは、SSVLはプールオプション（全ポジションを1本のチューブに入れます）、またはポジションごとのプールオプション（各ポジションを96ウェルプレートの別々のウェルに入れます）として納品することができます（表1）。表1にTwist社のSSVLの仕様を示します。
表1. TwistのSSVLの仕様（Twist Bioscience、2023a）。
| 製品形式 | 直鎖二本鎖DNA |
| 注文制限 | 本数制限なし |
| 収率 | 全ポジションを1本のチューブにプールします 合計1µg以上 全ポジションを96ウェルプレートに別々に配置、各ウェル1ポジション、各50～100 ng |
| 納期 | 3～4週間（プロジェクトによります） |
異変体ライブラリーを作製する従来の方法には、 ランダム変異誘発法DNA配列全体にランダムに変異を導入する技術。 More （エラーが起こりやすいPCR（error-prone PCR、epPCR）など）、 組換え変異誘発法 、 コンビナトリアル変異誘発法DNA配列内の複数の位置を同時に変異させる部位特異的手法であり、各変異体には複数の変異が含まれています。 More （NNK、TRIMなど）、 部位特異的変異誘発法二本鎖DNAやプラスミドのある領域、あるいは異なる領域内の特定の位置、あるいは連続したアミノ酸に変異を与える方法。 More などがありますが、一般に、コドン使用量の制御が制限され、配列バイアスが存在し、所望のバリアントの生成が不完全であるなどの欠点や限界があります。その代わりに、Twistはシリコンベースの合成プラットフォームを使って高品質のオリゴプールを生成し、正確で完全にカスタマイズされたユーザー定義のSSVLを構築します（Willems、2023）。表2は、TwistのSSVLの特徴を他の生成方法と比較したものです。
表2. 様々なSSVL生成法の比較（Twist Bioscience、2023b）。
| epPCR | NNK・NNS | TwistのSSVLs | |
| シーケンスバイアスを排除 | × | × | ○ |
| 利用可能なコドンの数 | 不明 | 32 | すべて64 |
| 不要なモチーフを除去 | × | × | ○ |
| コドンの最適化が可能 | × | × | ○ |
| ストップコドンの回避 | × | ○ | ○ |
SSVL合成ワークフロー
TwistのSSVLは、一度に100万個の オリゴヌクレオチドヌクレオチド数が少なく、短くて直鎖状のDNAまたはRNA More （オリゴ）配列を生成できる96ウェルプレートと同じフットプリントを持つシリコンベースのプラットフォーム上で合成されます（図1bの挿入突然変異の一種で、DNAセグメントに1つ以上のヌクレオチドが付加されます。 More部分）。このワークフローでは、シリコンベースの合成プラットフォームは、SSVL（図1d）の構築に使用される一本鎖オリゴのコレクションであるオリゴプールを生成します（図1bの挿入部分と図1c）。その後、ライブラリーのバリアントはアセンブルされ、発現ベクターにクローン化され、微生物中で増殖され、スクリーニングされ（図1e）、NGSによって配列決定された後（図1f）、顧客に出荷されます（図1g）（Twist Bioscience、2023a、b）。
図1. TwistによるSSVL合成のワークフロー。
SSVLの品質
図2は、epPCR（図2a）とTwistのオリゴ合成技術（図2b）によって作製されたSSVLのNGS QCレポートです。65の位置にバリアントを持つSSVL（各位置に19のバリアント）をepPCRで作製したものと比較しました（図2）。図2において、各バーは変異したアミノ酸の位置を表し、各色は特定のアミノ酸を持つバリアントの頻度を表します。epPCRと比較して、Twistで作製した異変体ライブラリーはアミノ酸比の均一性が高かったです。その結果、すべてのバリアントが期待される比率で存在し、平均99%のバリアントが構築されたことが示されました（Twist Bioscience、2023a）。
図2. a) Twistのシリコンベース合成プラットフォームとb) epPCRによって生成されたSSVLの品質比較（Twist Bioscience、2023b)。
参考文献
Twist Bioscience. (2023a). Variant libraries. Twist Bioscience. https://twistbioscience.yokohama/pdf/Brochure_Libraries_2OCT20_Rev1.0_1.pdf
Twist Bioscience. (2023b). Site saturation variant libraries. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/sites/default/files/resources/2020-06/ProductSheet_Libraries_SSVL_10JUN20_Rev2.0.pdf
Willems, B. (2023). Twist DNADNAは 「deoxyribonucleic acid」の略で（デオキシリボ核酸）、2本のポリヌクレオチド鎖からなるポリマーで、互いに巻きついて二重らせんを形成しています。 More variant libraries [PowerPoint slides]. Twist Bioscience.