新しいCLUEワークフローと単一のオリゴプールを使用した複数のカスタムCRISPRライブラリの生成

はじめに

プールされたクラスター化規則的に間隔をあけた短い回文反復 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat、 CRISPR ) スクリーニングは、単一の実験で数千の遺伝的摂動を調べる強力な方法です。遺伝子スクリーニングが成功すれば、薬剤に対する耐性や感受性など、対象の表現型の遺伝子機能について新たな洞察が得られる可能性があります (Sanjana、2017)。プールされたCRISPRスクリーニングは多くの場合in vitroで実施されていますが、in vivo（モデル動物）でも行われています。(Becker et al.、2020)。

CRISPR Cas9媒介システムは、多くの細胞型におけるプールされたCRISPRスクリーニングに適用されています(Aregger et al.、2018)。これは、合成シングルガイドRNA ( sgRNA )と Cas9 ヌクレアーゼで構成され、これらが一緒になってリボ核タンパク質複合体を形成し、DNAの特定の標的部位で二本鎖切断を行います。二本鎖切断が発生すると、細胞は切断を修復するためにエラープローン非相同末端結合（Non-homologous end-joining、NHEJ）修復経路などの修復機構を受けます。これによりフレームシフト 変異 が導入され、標的遺伝子の機能喪失が生じる可能性があります (Sanjana、2017)。機能喪失遺伝子の発現はスクリーニングによって分析でき、目的の表現型を引き起こす遺伝子は次世代シーケンス (Next generation sequencing、 NGS ) によって同定できます。

プールされたCRISPRスクリーニングを成功させるには、sgRNAライブラリーを構築するためのオリゴヌクレオチド (オリゴ) プールの合成から、標的遺伝子の機能喪失の生成に至るまで、スクリーニング前のすべてのステップを慎重に検討し、最適化する必要があります (Doench、2017）。特に、スクリーニングの成功は、適切なプールされた sgRNAライブラリーの使用に依存します (Chan et al.、2019)。現在、最もすぐに使用できるsgRNAライブラリは、単一のプール内に多数の固有のsgRNAで構成されるゲノムワイドライブラリです。これらのライブラリはゲノム全体のスクリーニングには有用ですが、サイズが大きいため、作製およびスクリーニングが技術的に困難です。さらに、これらのライブラリーにおけるsgRNAの表現は、プールの高度な複雑さによって悪影響を受ける可能性があります。多くの実験設定では、ゲノム全体にわたる大規模なライブラリーの代わりに、より小さくカスタマイズされたCRISPRライブラリーが好まれています (Read et al.、2017)。これは特に、初代細胞、オルガノイド、全動物を用いたin vivoスクリーニングに関連します（Becker et al.、2020）。

大規模なゲノムワイドライブラリーと同様に、カスタムsgRNAの生成も、多くの研究室にはその作製に必要な技術的および生物情報学の専門知識が不足しているため、技術的に困難です (Becker et al.、2020; Twist Bioscience、2023)。したがって、個々の研究室がカスタムCRISPRライブラリを生成できるようにする改善された方法が必要です。研究者がカスタム sgRNA ライブラリを使用して CRISPR スクリーニングをより適切に実行できるようにするために、カスタムライブラリ多重クローニング (Custom library multiplexed cloning、CLUE) と呼ばれる使いやすいバイオインフォマティクスおよびウェットラボワークフロー (www.crispr-clue.de）を開発しました。 CLUEをTwist Bioscienceの オリゴプール 合成と組み合わせることで、多数の高品質カスタムsgRNAライブラリの迅速な設計と並行生成が可能になります。このアプリケーションノートでは、Twist BioscienceのオリゴプールをCLUEワークフローに使用して、ライブラリ間の汚染なく均一なsgRNAライブラリを生成する方法について説明します。本研究の結果は、Twist BioscienceのオリゴプールとCLUEワークフローが、CRISPRスクリーニングのためのカスタムCRISPRライブラリーを、技術やバイオインフォマティクスにあまり詳しくない研究者でも容易に作成できる能力を示すものです。

CLUE ワークフローの原則

CLUE ワークフローの概略を図 1 に示します。CLUE ワークフローは、CRISPRスクリーニング用のカスタムsgRNAライブラリを生成することを目的としています。このワークフローは、WebベースのsgRNAライブラリ設計から、スクリーニング前の各カスタム sgRNAをクローニングするためのウェットラボ手順までのステップをカバーします (図 1)。

ウェットラボ手順 (図 1c、2) では、sgRNA 配列の基本構造として3つのDNAアダプターペアを交互に組み合わせて使用​​することが鍵となります。最も外側のアダプター (図 2a ～ i) により、オリゴプール全体が増幅されて二本鎖DNA が生成されます。二番目のアダプターペア (図 2a-ii) はプライマー結合部位として機能し、特定のsgRNAライブラリーの特異的な増幅を可能にします。 三番目の最も内側のアダプターペア (図 2a ～ iii) には、ギブソン アセンブリが可能なsgRNA発現ベクターと相同な配列が含まれています。３つのDNAアダプターペアを組み合わせて使用​​すると、単一の共有オリゴプールから多数のライブラリーを構築できます (図 2) (Becker et al.、2020)。

ウェットラボCLUEワークフローには、3つの連続するポリメラーゼ連鎖反応 ( PCR ) ステップが含まれます (図2)。最初のPCRステップ (PCR 1) には、多数のsgRNAライブラリーを含むオリゴ プールの合成、PCRによる増幅、得られた二本鎖DNAプールの TOPOベクターへのクローニングが含まれます (PCR 1; 図 2b)。次に、このTOPOプールから、特定のsgRNAライブラリーがPCR増幅されます (PCR 2、図 2c)。続いて、sgRNA発現ベクターへのギブソンクローニング反応のためにライブラリー特異的PCR産物が調製されます (PCR 3; 図 2d)。ギブソンクローニング反応後の最終生成物は、複数のカスタムsgRNA発現ライブラリーです (図 2e)。クローン化されたsgRNAライブラリの品質は、NGSによって評価できます (Becker et al.、2020)。

この研究では、オリゴプールから特定のsgRNAライブラリを増幅する (PCR 2) 前に、TOPOベクターへのsgRNAライブラリのサブクローニング (PCR 1) を実行する必要があります (図 2)。 Twist Bioscienceから得られるオリゴプールDNAの初期量は少ないため、PCR 1による増幅により、その後のPCR 2を実行するのに十分な DNA を取得できます (CRISPR CLUE、2023)。

図1. (a、b) ウェブツールと (c) ウェットラボで構成されCLUEワークフローの概略図。 a) CLUE ウェブページへの実験情報の入力 (www.crispr-clue.de）。 b) 最終的なオリゴ配列情報を含む CLUEからの出力。 c) ウェットラボプロトコルの最終生成物は、複数のカスタムsgRNA発現ライブラリーです (Becker & Braun、2020)。

図2. CRISPRスクリーニング用の複数のカスタムsgRNAライブラリを設計およびクローニングするためのCLUEワークフローの概略図。 (a) CLUE ワークフローで使用される単一のオリゴプールの構成とオリゴの基本構造。 a) では、オリゴの基本構造は3つのDNAアダプターペア (i-iii) を交互に組み合わせたものです。 b) 多数のsgRNAライブラリーから構成されるオリゴプールの合成、PCR増幅、およびTOPOベクターへのクローニング (PCR 1)。 c) b)のTOPOプールからの特定のsgRNAライブラリーのPCR増幅 (PCR 2)。d) sgRNA発現ベクターへの Gibsonクローニングのためのライブラリー特異的産物の調製 (PCR 3)。 e) 得られる生成物は、Gibson反応後の特異的なsgRNA発現ライブラリーです (Becker & Braun、2020)。

実験的なワークフロー

ステップ 1: sgRNA ライブラリーの生成

画面デザイン

最初のステップでは、生物の種類 (ヒトまたはマウス)、遺伝子摂動法 (CRISPR ノックアウト 、 CRISPRi または CRISPRa )、標的となる遺伝子または含まれるsgRNA配列、sgRNAベクターの種類、およびライブラリに含める遺伝子またはsgRNAを定義しました。標的遺伝子または標的sgRNA配列は、既存のゲノムワイドsgRNA参照ライブラリーから選択されました (Doench et al.、2016; Horlbeck et al.、2016; Wang et al.、2015)。実験情報は、CLUEのウェブページ（www.crispr-clue.de）の指示に従って入力ファイルとして書き込まれます（図1a）。

この研究では、図 2で説明したCLUEワークフローに従って、Twist Bioscienceのオリゴプールから10個のCLUE sgRNAライブラリを生成しました。各ライブラリーについて、選択したsgRNA配列に、それぞれオリゴプール増幅（PCR 1；図 2b）、ライブラリー特異的増幅（PCR 2；図 2c）およびGibson反応（PCR 3；図 2d）のための増幅 アダプター 配列（図 2a-i）、ライブラリー特異的アダプター配列（図 2a-ii）およびRNAポリメラーゼIIIプロモーター（U6またはH1）とsgRNA足場（ベクター相同列）（図 2a-iii）を付加しました（Becker et al.、2020）。

オリゴプール合成

実験情報を含む入力ファイルをCLUE作業ツールにアップロードしました (図 1a)。最終的なオリゴプール配列情報を含むCLUEによって生成された出力ファイルをダウンロードし (図 1b)、オリゴ合成のためにTwist Bioscienceに提出されました (Twist Bioscience、2023)。 Twist Bioscienceは、シリコンプラットフォーム上でオリゴプールを合成しました。

ステップ2: PCR増幅とオリゴプール全体のクローニング

凍結乾燥オリゴプールをTwist Bioscienceから受け取ったら、TEバッファーで再構成し、Kapa Hifi DNAポリメラーゼ（Roche Ltd.）および初期増幅プライマーを使用してPCR増幅しました（PCR 1、図2b）。 PCR 1 の条件は、98℃ 3分 (初期化)、98℃ 30秒 (変性)、62℃ 15秒 (アニーリング)、72℃ 10秒 (伸長/伸長)、72℃ 2 分 (最終伸長）、合計 15PCR サイクル。 PCR反応は、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット (Life Technologies Corp.) を使用してTOPOベクターに直接クローン化した。次に、TOPOプラスミドを精製し、EnduraRエレクトロコンピテントセル (Lucigen Corp.) で形質転換し、NucleoBond Xtra Maxi Kit (Macherey-Nagel GmbH) を使用して単離しました (Becker et al.、2020; Twist Bioscience、2023)。

ステップ3: sgRNAライブラリのクローニング

TOPOオリゴ プールは、その後のクローニングのために最初のオリゴプールに含まれる特定のsgRNAライブラリを増幅するためのテンプレートとして使用されました (PCR 2、図 2c)。 PCR 2の増幅は、98℃ 2分、98℃ 20秒、57 ～ 62℃ 15秒、72℃ 1秒、72℃ 1分の条件下でライブラリー特異的プライマーを使用し、合計30 PCRサイクル実施しました。増幅されたPCR産物は、NucleoBond Xtra Maxi Kit (Macherey-Nagel GmbH) を使用して精製され、精製されたDNA断片はGibsonクローニングに使用されました (PCR 3; 図 2d) (Becker et al.、2020; Twist Bioscience、2023)。

ギブソンクローニングは、重複するPCR産物または DNAフラグメントを組み立てる方法です (PCR 3、図 2d)。PCR 3はPCR 2と同じ熱サイクル条件下で実施しました。PCR 3で生成した断片を、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, Inc.) を使用して線形化sgRNA発現ベクターにクローニングしました。 PCR 1と同様に、クローニング産物をEnduraRエレクトロコンピテントセル (Lucigen Corp.) で形質転換し、NucleoBond Xtra Maxi Kit (Macherey-Nagel GmbH) を使用して単離しました (Becker et al.、2020; Twist Bioscience、2023)。

ステップ4: NGS sgRNAライブラリの調製とNGS品質管理評価

NGSを実行して、得られたsgRNAライブラリーの品質を評価しました。 NGS用の sgRNAライブラリーは、アダプター (Illumina, Inc.)、バーコード、およびsgRNAベクターに相補的な配列を含むプライマーを使用して調製されました。 PCは98℃ 2分、98℃ 30秒、62℃ 15秒、72℃ 20秒、72℃ 2分の条件で計25サイクル行いました。増幅されたPCR産物は、NucleoSpin GelおよびPCR Clean-Up Kit（Macherey-Nagel GmbH）を用いた アガロースゲル電気泳動 で精製した後、Illumina HiSeq 2000（Illumina, Inc.）で、50 bpシングルエンドリードでsgRNAあたり500リード以上の深度でシーケンスしました。sgRNAライブラリのNGSデータはカスタムPythonスクリプトを使用して分析され、オリゴプール全体または特定のsgRNAライブラリのいずれかへの読み取りがマッピングされました(Becker et al.、2020; Twist Bioscience、2023)。

ステップ5: プールされたCRISPRiスクリーニング

CLUEワークフローによって設計および構築されたsgRNAライブラリが、プールCRISPR スクリーニングで使用された場合に生物学的に意味のあるヒットを生成する能力をテストするために、CRISPRiスクリーニングを実行しました (図 3)。このスクリーニングのために、ヒト神経膠腫細胞株であるU87-MG細胞（ATCC HTB-14）（図3a）を、強化型緑色蛍光タンパク質（EGFP）でタグ付けした核酸分解型Cas9（dCas9）をコードする レンチウイルス ベクターでトランスフェクトした（図3b）。dCas9-EGFを発現する細胞は、 蛍光活性化セルソーティング （FACSによって濃縮されました（図3c〜e）。続いて、U87-MG dCas9-EGFP細胞にCLUEライブラリーを低感染率で形質導入し、細胞あたり 1つのsgRNA感染を確実にしました (図 3f、g)。形質導入に成功した細胞は、FACSによって再度濃縮され、スクリーニングの前に培養内で増殖されました。細胞の一部を対照として培養0日目に採取し、残りを培養しました。In vitroで16日間 (図 2h)。 16日目にも細胞を回収しました。Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corp.) を用いてゲノムDNAを抽出し、98℃ 2分、98℃ 20秒、62℃ 15秒、72℃ 1秒、72℃ 1分、合計30 PCRサイクルの条件でPCRを行いました（図3i）。PCR産物は精製および配列決定され（図3i）、NGSデータはすべてステップ4と同じ条件下で分析されました。マッピングおよび読み取りカウントのためのカスタムPythonスクリプトに加えて、MAGeCKソフトウェアもNGSデータ分析に使用されました。

図3. プールされた CRISPRi スクリーンの概略図。

結果と考察

CLUE sgRNA ライブラリーの均一性と品質

合計5,585のsgRNA を含むオリゴプールが、10の異なるsgRNAライブラリー間で設計されました (表 1)。オリゴプールの増幅後、PCR反応をTOPOベクターに直接クローニングし、TOPOプラスミドを精製し、EnduraRエレクトロコンピテントセルに形質転換し、その後単離しました (PCR 1; 図 2b)。単離されたプラスミドプールは、均一性を評価するためにNGSに供されました。図 4は、初期TOPOプールに含まれるオリゴの分布を示しています。正規分布が観察され、90%を超えるsgRNAが分布平均の1 log以内に分布しており、使用したsgRNAライブラリーの均一性が高いことが確認されました。

図4. NGS 分析から得られた初期TOPOオリゴプールに含まれるオリゴの分布 (Twist Bioscience、2023)。

PCR 1 (図 2b) を実行した後、ライブラリー特異的 PCR (PCR 2; 図 2c) およびその後のクローニングステップ(PCR 3; 図 2d) を実行して、10 個の個別のCLUE sgRNAライブラリを生成しました。10 個の CLUE ライブラリーすべての品質をNGSによって評価し、その結果を表 1に示します。sgRNAクローニング効率は、クローニング反応から得られた正しいsgRNAの数の精度の尺度です。 10個のCLUE ライブラリーのうち、6個は 100%のsgRNA クローニング効率で完全に表現されましたが、4個は1つのsgRNAが欠落していました (つまり、sgRNAクローニング効率が100%未満) (表 1)。

表1。CLUEワークフローを使用して設計および構築されたプールされたsgRNAライブラリの NGS分析データ (Twist Bioscience、2023)。

表 1に完全に一致するNGSリードの割合で表されるように、PCRとクローニングの精度を分析しました。全リードの94%までが元のオリゴプールと一致し、CLUEワークフローにおけるPCRとクローニングの精度が確認されました (表 1)。各プールされたライブラリーで厳密な正規分布が観察され、>90%のsgRNAが分布の平均の1対数以内に収まりました。これは、sgRNAがすべてのライブラリーで均一に表現されていることを示しています。表 1のライブラリ1 ～ 3の分布を図 5に示します。

ライブラリ間の汚染なしに個々のライブラリを増幅するCLUEワークフローの機能を評価するために、増幅されたライブラリ以外のライブラリへのリード マッピング (表 1) を取得しました。増幅されたライブラリー以外の他のライブラリーにマッピングされているリードは0.5%未満しか検出されず、CLUEワークフローによって生成されたライブラリーの特異性が高いことを示しています (表 1)。このセクションでは、結果は、CLUEワークフローで生成されたsgRNAライブラリーが高精度で均一性が高く、ライブラリー間汚染がほとんどなく、プールされたCRISPRスクリーニングの品質基準要件を満たしていることを示しています (Joung et al.、2017)。

図5.　NGS 分析から得られた表 1のライブラリ1 ～ 3の分布 (Twist Bioscience、2023)。

CLUEライブラリを備えたCRISPRiスクリーニング

プールされたCRISPRiスクリーニングは、スクリーニングに使用されたときに生物学的に意味のあるヒットを生成するCLUEワークフローによって設計および構築された sgRNAライブラリの機能をテストするために実行されました。 dCas9-EGFPで形質導入されたU87-MG神経膠腫細胞を使用してCRISPRiを誘発した。次に、dCas9-EGFP発現 U87-MG 細胞を、88の異なる転写調節因子を標的とする505のsgRNAからなるCLUE ライブラリーに感染させました。In vitroで培養は16日間続き、その後細胞が回収され、ゲノムDNAが抽出、増幅され、NGSによって配列決定されました。

CRISPRスクリーニングのヒットは通常、スクリーニング前後のsgRNA発現の変化を比較することによって特定されます。この研究では、0日目と16 日目に単離されたNGS 分析ゲノムDNAが比較され (図 6)、神経膠芽腫増殖の転写調節因子が同定されました。 NGSによって分析され、MAGeCKのsgRNAランキングアルゴリズムを使用して確認されたCRISPRiスクリーニング結果を図6に示します。転写因子E2F1やジンクフィンガー タンパク質217 ( ZNF217) は神経膠腫細胞の培養中に枯渇しました。これらの結果は、CLUEライブラリーがプールされたCRISPRスクリーニングで癌遺伝子などの生物学的関連遺伝子を同定できることを示しています。

図6. NGSによるCRISPRiスクリーン解析。 16 日間の標的遺伝子の枯渇の重要性のプロット。In vitroで培養。赤い線が表すのは、p= 0.05。黒色のデータ ポイントは、大幅に減少した遺伝子を表します (p < 0.05) (Twist Bioscience、2023)。

結論

Twist Bioscienceのオリゴ合成とCLUEワークフローを組み合わせて使用​​することで、カスタムsgRNAライブラリを生成し、CRISPRiスクリーニングに適用することに成功しました。 sgRNAの均一性とオリゴ配列の忠実度は、CRISPRスクリーニングを成功させるための重要なパラメータです。この研究では、Twist Bioscienceのオリゴプールを使用して生成されたCLUEライブラリは、100%に近いsgRNAクローニング効率で非常に正確でした。また、それらは、それらが由来する最初のオリゴプールへの高いマッピング率によって明らかなように、ライブラリ間の汚染がほとんどなく、均一なsgRNA分布を示しました。 CRISPRiスクリーニングで高品質のCLUEライブラリを使用することにより、癌遺伝子などの生物学的に意味のあるヒットを特定することができました。この研究の結果は、Twist Bioscienceによって合成された高品質のオリゴプールとCLUEワークフローを組み合わせることで、プールされたCRISPRスクリーニング用のsgRNAライブラリの設計と構築が容易になったことを示しています。

参考文献

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