高品質のオリゴプールを使用して貪食作用モジュレーターを特定するためのカスタムターゲットCRISPRスクリーニング

はじめに

貪食作用 （ファゴサイトーシス）は、細胞が0.5 μmを超える粒子を取り込み、 食胞 （ファゴソーム）として知られる原形質膜由来の小胞に取り込む重要な細胞プロセスです (Rosales & Uribe-Querol、2017)。このプロセスは主に、病原体の終結、死細胞または死にかけている細胞の除去、および細胞破片の除去に使用されます (Lindner et al.、2021)。古典的な貪食細胞 (食細胞としても知られています) は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、破骨細胞、および好酸球です。食作用が起こるためには、食細胞は、その細胞表面受容体と標的粒子上のリガンドとの間の相互作用を介して標的粒子を認識する必要があります。標的粒子の認識後、貪食受容体は一連のシグナル伝達イベントを開始して、貪食のための内在化機構を活性化します。これらには、細胞膜および アクチン細胞骨格 の脂質のリモデリングが含まれ、その結果、粒子摂取のために粒子を覆うように膜が拡張します (Haney et al.、 2018; Rosales & Uribe-Querol、2017)。

食作用は、病原体の防御から組織の 恒常性 まで、幅広い生理学的機能にとって重要です。食作用の調節不全は、恒常性の喪失をもたらす可能性があり、さまざまな疾患の病因と関連しています (Lindner et al.、2021; Potere et al.、2019)。食作用は複雑なプロセスであるため、食作用の根底にある多くの生化学的メカニズムは不明のままです。遺伝子スクリーニング技術を用いた食作用に関与する遺伝子の解析は行われていますが、哺乳動物の食作用を調節する遺伝子に関する研究はまだ限られています (Lindner et al.、2021)。

CRISPR/Cas9を介した遺伝子 ノックアウト (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat screening、 CRISPR スクリーニング) を使用した遺伝子スクリーニング技術は、複雑な細胞プロセスを調査するための強力なツールです。 CRISPRスクリーニングでは、遺伝子型と表現型の関係を効率的に特徴付けるために、多数の細胞集団で数千の個々の遺伝子を同時にノックアウトできます (Lindner et al.、2021)。 CRISPRスクリーンを実行するには、正確で均一なオリゴヌクレオチド (オリゴ) プールからのシングルガイド RNA ( sgRNA ) ライブラリの合成が重要です。

このアプリケーション ノートでは、Twist Bioscienceの オリゴプール を使用してカスタム CRISPRスクリーニング (ゲノム全体および焦点を絞ったCRISPRスクリーニング) を実行し、THP-1細胞における黄色ブドウ球菌の食作用を調節する遺伝子を同定する方法について説明します。2 つの CRISPR スクリーンから得られた選択されたヒットに対する単一遺伝子ノックアウトの検証結果と、追加の貪食標的粒子で特徴付けられたヒットもここに記載されています。この研究の結果は、食作用の遺伝的調節因子の範囲を広げる可能性があり、食作用に関与する根底にあるメカニズム、およびヒトの疾患プロセスにおけるそれらの調節と役割をさらに調査するための将来の研究に役立ちます。

実験ワークフロー

ステップ 1: 操作された THP-1 iCas9細胞の生産

活性化や分化を必要とせずに細菌を自発的に貪食するTHP-1細胞株が使用をしようしました。 THP-1細胞で Cas9 活性を誘導および制御するために、細胞をTET誘導性Cas9-GFP (THP-a iCas9) 細胞に設計しました。このシステムにより、Cas9は、遺伝子編集またはsgRNAライブラリー スクリーニングに必要な場合に、ドキシサイクリン (dox) の存在下で発現することができます。THP-a iCas9細胞を誘導するために、THP-1細胞に pLenti-EF1A-rtTA3-IRES-EcoRec-PGKPuro (図 1a、b) および pLenti_TRE3G-Cas9-P2A-GFP (図 1c、d) を連続的に導入しました。 pLenti-EF1A-rtTA3-IRES-EcoRec-PGKPuro は dox 誘導性 Cas9 発現を可能にする プラスミド 、pLenti_TRE3G-Cas9-P2A-GFP は Cas9 と緑色蛍光タンパク質 (Green fluorescent protein、GFP) を発現する発現 ベクター です。

ステップ 2: CRISPR sgRNA ライブラリーの構築

sgRNA ライブラリーの設計

目的の遺伝子が選択され、これらの遺伝子に対する適切な sgRNA ライブラリが設計されました (図 1e)。

sgRNA エンコード オリゴ プールの合成

sgRNA をコードするオリゴ プールはTwist Bioscience のシリコン プラットフォーム上で 合成しました。合成が完了したオリゴプールはシリコン固体支持体から切断され、回収されました (図 1f)。

オリゴプール増幅

オリゴプールは、ポリメラーゼ連鎖反応（ PCR ）によって増幅されました（図 1g）。

オリゴプールクローニング

プール内の個々のオリゴを発現ベクターにクローニングし（図 1h）、プラスミドライブラリープールを作成しました（図 1i）。

ステップ 3: レンチウイルスのパッケージング

プラスミドプールは、マウス表面タンパク質Thy1.1を共発現する レンチウイルス 粒子にパッケージ化されました（図 1j）。 Thy1.1 は、それに対する抗体に結合したCD90.1磁気マイクロビーズの結合を可能にする表面抗原です。

ステップ 4: THP-a iCas9細胞のレンチウイルス感染

THP-1 iCas9細胞に、CRISPR sgRNAライブラリーを含むレンチウイルスを導入しました (図 1k)。

ステップ 5: 磁気マイクロビーズによる MACS 精製

sgRNAライブラリーを含む形質導入THP-1 iCas9細胞を、マイクロビーズに結合した抗体と細胞表面のThy1.1との相互作用を介して、磁気活性化セルソーティング ( MACS ) CD90.1磁気マイクロビーズで標識しました。 sgRNAライブラリーの有無にかかわらず、形質導入された細胞をMACSで分離しました（図1l）。 Cas9誘導およびCRISPRノックアウトスクリーニングのために、sgRNAライブラリーを含む細胞を収集しました。

ステップ 6: dox およびCRISPRノックアウト スクリーンによる Cas9 誘導

形質導入されたTHP-1 iCas9細胞は、2日間連続してdoxで刺激されました。 doxの存在下では、Cas9の発現がGFP蛍光により確認されました。 (図 1m)。

食作用に関与する遺伝子を特定および検証するために、3つのCRISPRノックアウト実験を行いました。ゲノム全体のCRISPRスクリーニングから始まり、焦点を絞ったスクリーニング、最後に単一遺伝子ノックアウトの検証が行われました。

ステップ 7: 食作用アッセイ

形質導入の14日後、pHrodo redで標識された黄色ブドウ球菌を、形質導入および濃縮されたTHP-1 iCas9細胞に添加し、60分間貪食させました(図 1n)。

ステップ 8: 蛍光活性化セルソーティング (Fluorescence activated cell sorting、FACS)

60分後、細胞を抗Thy1.1-APCおよびDAPIで染色し、従来のセルソーターで選別しました。 pHrodo redの蛍光強度に基づいて細胞を選別し、貪食細胞 (高pHrodo赤強度) と非貪食細胞 (低pHrodo赤強度) を分離しました (図 1o)。

ステップ 9: アンプリコン シーケンス

FACS濃縮細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出した。組み込まれたsgRNAをPCRで増幅し、NextSeq 550 (Illumina) で配列決定しました (図 1p)。

ステップ 10: データ分析

最初のゲノムワイドおよび二次フォーカススクリーンからのデータをMAGeCK-VISPRソフトウェアで分析して、食作用に関与する遺伝子を特定しました（図 1q）。

ステップ 1 ～ 10 を2番目のフォーカス スクリーンとその後の単一遺伝子CRISPRノックアウト実験で繰り返し、毎回ヒットを選択し、次のターゲット スクリーン用に新しいターゲット sgRNAライブラリを設計しました。単一遺伝子ノックアウト検証では、黄色ブドウ球菌、大腸菌、ザイモサンAも食作用アッセイの基質として使用されたことに注意してください。

図 1. CRISPR sgRNA ライブラリーの構築、およびゲノムワイドでフォーカスを絞った CRISPRスクリーンの実験ワークフロー。

結果と議論

食作用に関与する遺伝子の同定

図 2は、ゲノムワイドおよび焦点を絞ったスクリーニングによって同定された食作用に関与する遺伝子を示しています。最初のゲノムワイドなCRISPRスクリーニングでは 18,187の遺伝子が調査され、そのうち211の遺伝子のsgRNAがノックアウト後に形質導入細胞で枯渇していました。したがって、これらの遺伝子は細胞の生存に不可欠であることが確認されました。残りの17,976個の遺伝子のうち、831個の遺伝子が黄色ブドウ球菌の食作用に重要であることがわかりました (ヒット) (誤検出率 (FDR)* ≤ 0.2)。最初のゲノム全体のスクリーニングから偽陽性のヒットを除外するために、二次的な焦点を絞ったスクリーニングでこれらの831個の遺伝子をさらに調査しました。これらのうち、101件のヒットが特定されました (FDR ≤ 0.1)。ゲノム全体のスクリーニング データを FDR ≤ 0.1で再解析すると、322ヒットが特定されました。両方の画面の結果を相互参照し、75件のヒットが高い信頼性で特定され、そのうち28件が食作用を活性化し、47件が食作用を阻害しました。

図 2. (a) 最初のゲノムワイド スクリーンとそれに続くフォーカス スクリーンによる食作用に関与する遺伝子の順次同定。 (b) 高レベルおよび低レベルの食作用を伴うヒット。 *False Discovery Rate (FDR) は、予想される偽陽性のレベルです (Rouam、2013; Twist Bioscience、2023)。

信頼度の高いヒットのさらなる分析

ゲノム全体および焦点を絞ったスクリーニングによって得られた結果の分析後に特定された 75の信頼性の高いヒットは、それらの生物学的機能に従って分類され、図 3に示されています。

細胞骨格の再構築と調節に関与する遺伝子は、大きな負のベータ スコアによって示されるように、食作用に最も大きな影響を与えました (図 3)。

これはおそらく、アクチン細胞骨格の動的活性がファゴソーム形成に不可欠であるという事実によるものと考えられます。さらに、GTPase シグナル伝達に関与する RAB7A は、ファゴソーム成熟として知られるプロセスにおける膜構造のリモデリングとその内容物の組成を促進する上で重要であるため、食作用にも影響を与えました (図 3)。一方、グリコシル化に関与する5つの遺伝子のノックアウトによる機能の喪失は、食作用の増加をもたらしました。グリコシル化と食作用の関係を調べるには、さらなる研究が必要です。

単一遺伝子CRISPRノックアウトによる高信頼ヒットの検証

同定された信頼性の高いヒットを検証するために、グリコシル化に関与する5つの遺伝子 (SLC35A2、SLC35A3、B3GNT2、UXS1、およびUGCG) と翻訳調節に関与する2つの遺伝子 (EIF5AおよびDHPS) を単一遺伝 CRISPRノックアウト用に選択しました (丸で囲んだ遺伝子) 図 3 の青色)。この検証実験では、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびザイモサンAも食作用についてアッセイを行いました。単一遺伝子のノックアウト後、EIF5AとDHPS は、3つの基質の機能を失った後の食作用の減少をもたらしました。したがって、EIF5AとDHPSはアクチン細胞骨格の再構築の制御に寄与すると予測されます (Rossi et al., 2014)。一方、グリコシル化遺伝子 SLC35A2、SLC35A3、UXS1、およびUGCG は、遺伝子ノックアウトの結果として、基質の食作用の増加を示しました。グリコシル化と食作用の関係は不明のままであるため、さらなる研究が必要です。単一遺伝子ノックアウトの結果は、2つのスクリーニングから得られた結果と同様であり、結果の妥当性が確認されました。

図 3. ゲノムワイドおよび焦点を絞ったスクリーンによって特定された75の信頼性の高いヒットに対する食作用アッセイの結果。ヒットは、異なる機能グループに分類されました。バーは各遺伝子のベータ スコアを表します。これは、食作用アッセイによって課される遺伝子選択の測定値です (Li et al.、2015)。正と負のベータ スコアは、それぞれ、遺伝子が正 (つまり、ノックアウトが食作用を活性化) または負 (つまり、ノックアウトが食作用を損なう) に選択されていることを示します。青色の丸で囲まれた遺伝子は、単一遺伝子ノックアウトの検証のために選択されました (Twist Bioscience、2023)。

結論

ゲノム全体および焦点を絞ったCRISPRスクリーンなどのカスタムスクリーニングでは、Twist Bioscienceによって製造された均一で正確なオリゴ プールを使用して、食作用に関与する遺伝子を特定することに成功しました。ゲノムワイド スクリーンとそれに続くフォーカス スクリーンの使用は、食作用のモジュレーターとしての遺伝子を特定および検証するのに役立つことが証明されています。このワークフローにより、食作用に関与する75の信頼性の高い遺伝子が同定されました。これらのうち、細胞骨格の再構築に重要な遺伝子は、食作用の速度に最大の影響を及ぼしました。この研究の結果は、カスタム スクリーンに合成オリゴ プールを使用することで、貪食作用の遺伝的制御因子に関する洞察が得られたことを示しています。これは、ヒトの疾患における根底にあるメカニズムとその役割を解明するための将来の研究にとって価値があります。

参考文献

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Li, W., Köster, J., Xu, H. et al. (2015) Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol., 6:281. doi: 10.1186/s13059-015-0843-6. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26673418/

Lindner, B., Martin, E., Steininger, M. et al. (2021). A genome-wide CRISPR/Cas9 screen to identify phagocytosis modulators in monocytic THP-1 cells. Sci Rep., 11:12973. doi: 10.1038/s41598-021-92332-7.　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9892931/

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Rosales, C., Uribe-Querol, E. (2017). Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int., 2017: 9042851. doi:10.1155/2017/9042851.　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28691037/

Rossi, D., Kuroshu, R., Zanelli, C. F., et al. (2014). eIF5A and EF-P: two unique translation factors are now traveling the same road. Wiley Interdiscip Rev RNA, 5(2):209-222. doi:10.1002/wrna.1211.　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24402910/

Rouam, S. (2013). False Discovery Rate (FDR). In: Dubitzky, W., Wolkenhauer, O., Cho, KH., Yokota, H. (eds) Encyclopedia of Systems Biology. Springer, New York, NY.　https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007/978-1-4419-9863-7_223

Twist Bioscience. (2023). Identifying genetic drivers of Innate immunity using custom targeted CRISPR screens. Twist Bioscience. https://www.twistbioscience.com/resources/application-note/identifying-genetic-drivers-innate-immunity-using-custom-targeted-crispr.